Accepted_test

Особенности синтеза P-NH2 олигонуклеотидов по адаптированной методике на основе стандартного амидофосфитного протокола
Authors:
Evgeniia Malova, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SB RAS, Novosibirsk, Russia
Pyshnaya Inna, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SB RAS, Novosibirsk, Russia
Meschaninova Maria, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SB RAS, Novosibirsk, Russia
Pyshnyi Dmitry, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SB RAS, Novosibirsk, Russia
Abstract ID: 540
Event: BGRS-abstracts
Sections: [Sym 11] Section “DNA replication and repair”

Предложен новый подход к автоматизированному синтезу N-незамещенных амидофосфатных олигодезоксирибонуклеотидов (P-NH2), основанный на оптимизированном протоколе твердофазного фосфитамидного синтеза с использованием реакции Штаудингера. Показано быстрое и эффективное окисление модельных P(III)-содержащих фосфиттриэфиров органическим азидом – (9-флуоренил)-метоксикарбонилазид (FmocN3) – до соответствующих фосфамидов -(OPO(OR)(NFmoc))-, где R – остатки нуклеозидной или алкильной природы. Удаление щелочелабильной флуоронильной группы с модифицированного межнуклеозидного звена позволяет получать в цепи олигонуклеотида электронейтральные, при физиологических условиях pH ~ 7, N-незамещённые амидофосфатные (–(OPO(O)(NH2))– или (P-NH2)) остатки вместо классических отрицательнозаряженных фосфодиэфиров (–(OPO(O)(O¯))–) или (P-O)).

При оптимизации синтетического протокола продемонстрировано, что для повышения эффективности синтеза P-NH2-олигонуклеотидов (до ~ 80% на модифицированное звено) необходимо включение в протокол автоматического синтеза дополнительной стадии отщепления Fmoc-группы после проведения каждой стадии окисления растущей цепи олигомера по реакции Штаудингера. Показано практически полное отсутствие зависимости выхода P-NH2-олигонуклеотидов как от локализации P-NH2-звена в цепи, так и от типа модифицируемого динуклеотидного фрагмента. Получен набор моно- и бис-модифицированных октадезоксирибонуклеотидов и проведено детальное исследование термической стабильности комплементарных ДНК/ДНК комплексов в различных буферных условиях. Показано, что в условиях высокой ионной силы раствора (1 M NaCl, pH 7,2) введение одного P-NH2-звена снижает термостабильность комплекса ДНК в среднем на 1,3 оС. При уменьшении ионной силы раствора дестабилизирующий эффект P-NH2-модификации достоверно снижается, что дополнительно подтверждает электронейтральный статус вводимого амидофосфатного звена. Таким образом, нами разработан протокол получения частично модифицированных производных олигонуклеотидов, несущих незаряженные, но изоструктурные к нативным P-O-звеньям – амидофосфатные остатки P-NН2.