Accepted_test

Особенности синтеза P-NH2 олигонуклеотидов по адаптированной методике на основе стандартного амидофосфитного протокола
by Evgeniia Malova | Pyshnaya Inna | Meschaninova Maria | Pyshnyi Dmitry | Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SB RAS, Novosibirsk, Russia | Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SB RAS, Novosibirsk, Russia | Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SB RAS, Novosibirsk, Russia | Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SB RAS, Novosibirsk, Russia
Abstract ID: 540
Event: BGRS-abstracts
Sections: [Sym 11] Section “DNA replication and repair”

Предложен новый подход к автоматизированному синтезу N-незамещенных амидофосфатных олигодезоксирибонуклеотидов (P-NH2), основанный на оптимизированном протоколе твердофазного фосфитамидного синтеза с использованием реакции Штаудингера. Показано быстрое и эффективное окисление модельных P(III)-содержащих фосфиттриэфиров органическим азидом – (9-флуоренил)-метоксикарбонилазид (FmocN3) – до соответствующих фосфамидов -(OPO(OR)(NFmoc))-, где R – остатки нуклеозидной или алкильной природы. Удаление щелочелабильной флуоронильной группы с модифицированного межнуклеозидного звена позволяет получать в цепи олигонуклеотида электронейтральные, при физиологических условиях pH ~ 7, N-незамещённые амидофосфатные (–(OPO(O)(NH2))– или (P-NH2)) остатки вместо классических отрицательнозаряженных фосфодиэфиров (–(OPO(O)(O¯))–) или (P-O)).

При оптимизации синтетического протокола продемонстрировано, что для повышения эффективности синтеза P-NH2-олигонуклеотидов (до ~ 80% на модифицированное звено) необходимо включение в протокол автоматического синтеза дополнительной стадии отщепления Fmoc-группы после проведения каждой стадии окисления растущей цепи олигомера по реакции Штаудингера. Показано практически полное отсутствие зависимости выхода P-NH2-олигонуклеотидов как от локализации P-NH2-звена в цепи, так и от типа модифицируемого динуклеотидного фрагмента. Получен набор моно- и бис-модифицированных октадезоксирибонуклеотидов и проведено детальное исследование термической стабильности комплементарных ДНК/ДНК комплексов в различных буферных условиях. Показано, что в условиях высокой ионной силы раствора (1 M NaCl, pH 7,2) введение одного P-NH2-звена снижает термостабильность комплекса ДНК в среднем на 1,3 оС. При уменьшении ионной силы раствора дестабилизирующий эффект P-NH2-модификации достоверно снижается, что дополнительно подтверждает электронейтральный статус вводимого амидофосфатного звена. Таким образом, нами разработан протокол получения частично модифицированных производных олигонуклеотидов, несущих незаряженные, но изоструктурные к нативным P-O-звеньям – амидофосфатные остатки P-NН2.