The use of CRSIPR/Cas9 scarless system to generate Drosophila melanogaster line with point mutations
Zhukova M.1*, Yakovlev K.2, Shidlovskii Y.1, 3
1 Institute of Gene Biology, RAS, Moscow, Russia
2 A.V. Zhirmunsky National Scientific Center of Marine biology, FEB RAS, Vladivostok, Russia
3 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow, Russia
* zhukovamv@gmail.com
Poster_Zhukova_7_1-03
Добрый день, у меня вопрос: С какой частотой идет процесс внедрения нужных последовательностей в геном? Сколько нужно плазмид (штук или мг)в соотношении с ДНК-мишенью, чтобы событие произошло. Я пытаюсь спросить, можно ли оценить эффективность работы траспозазы. сколько внедрений на сайт за поколение может обеспечить транспозаза.
Здравствуйте.
Мы закалываем в эмбрионы раствор из двух (или трех) плазмид, суммарная концентрация плазмид не более 600 нг/мкл. Донорной плазмиды 500 нг/мкл и gRNA 100 нг/мкл (если две gRNA, то донорной плазмиды 400 нг/мкл). Cas9 экспрессируется в самой линии. Эффективность рекомбинации – не менее 5 независимых случаев на 200 инъецированных эмбрионов. Эффективность этого метода зависит от положения в геноме желаемой модификации и человека, который готовит растворы и закалывает эмбрионы.
Транспозаза работает на стадии вырезания селективного маркера из полученной линии в результате рекомбинации. В нашем случае эффективность была крайне низкая, мухи были получены только во втором поколении. В публикации об использовании транспозазы для вырезания у дрозофилы эффективность около 5-10% (статья, где впервые использовали линию 8285 для вырезания), что отличается от наших данных.